Що варто знати про 6 компонентів ВЕРХ? Без зайвого тиску!

ВЕРХ (високоефективна рідинна хроматографія) набрала обертів у 1960-х і 1970-х роках, коли вчені почали менше покладатися на просту гравітацію для переміщення рухомої фази і почали використовувати насос. А далі, як то кажуть, історія.

У 1952 році Арчер Дж. П. Мартін та Р. Л. Міллінгтон Сінг отримали Нобелівську премію з хімії за свою новаторську роботу з хроматографії — «винахід методу розподільної хроматографії». З того часу ВЕРХ (і ультрависокоефективна рідинна хроматографія, або УВЕРХ) продовжує розвиватися з допомогою інновацій та різних компонентів, що зробило її сьогодні широко використовуваним методом. Але важливо розуміти функції ключових частин ВЕРХ, щоб краще оцінювати її потенціал.

Виділимо шість основних компонентів системи ВЕРХ:

1. Рухома фаза

Для проведення зразка через хроматографічну систему в ВЕРХ використовують рідину, яка називається рухомою фазою. Склад рухомої фази надзвичайно важливий, оскільки він може суттєво впливати на розподіл різних сполук між рухомою фазою і матеріалом насадки всередині хроматографічної колонки. Чистота розчинника, що використовується в якості рухомої фази, а також тип і концентрація будь-яких буферів або добавок можуть суттєво впливати на утримання і подальше розділення різних сполук на хроматографі.

Нерідко для ВЕРХ-аналізу використовують більше ніж один склад рухомої фази, що вимагає засобів для заміни та змішування різних розчинників під час хроматографічного розділення.

2. Нерухома (стаціонарна) фаза

Колонка для ВЕРХ або УВЕРХ, найчастіше, заповнена крихітними пористими частинками кремнезему, які часто (але не завжди!) мають поверхню, модифіковану певною хімічною сполукою, що впливає на взаємодію зразка з частинками кремнезему. Ці частинки кремнезему з покриттям в ідеалі не рухаються під час хроматографічного розділення, тому їх називають стаціонарною фазою. Саме відносна взаємодія певної хімічної речовини з рухомою і нерухомою фазами визначає, наскільки добре вона утримується, а різні ступені взаємодії допомагають визначити, наскільки добре можуть бути розділені дві або більше хімічних речовини при проходженні через хроматограф. Нерухома фаза міститься всередині хроматографічної колонки.

3. Насоси

Також відомий як система подачі рухомої фази (або розчинника), насос в системі ВЕРХ підтримує постійний потік рухомої фази через прилад, незважаючи на протитиск, викликаний опором потоку в колонці ВЕРХ. Стандартний насос для ВЕРХ може працювати при протитиску до 6000 psi (≈ 400 бар), тоді як насос для УВЕРХ зазвичай перевищує 8500 psi (≈ 600 бар) і може досягати 18000 psi (≈ 1200 бар).

Визначивши, який тип розчинників і сумішей потрібен, необхідно вибрати сумісний насос, щоб уникнути пошкодження системи. Системи ВЕРХ/УВЕРХ PerkinElmer LC 300 можуть поставлятися з двома типами насосів для рухомої фази:

• Бінарні насоси, або змішувальні насоси високого тиску, використовують два незалежні насоси для подачі різних розчинників у змішувач.

• Четвертинні насоси, або змішувальні насоси низького тиску, складаються з одного насоса, який всмоктує певну порцію кожного розчинника через систему клапанів перед змішуванням.

4. Колонка

Колонка — це серце процесу розділення в хроматографії. При виборі РХ-колонки необхідно враховувати, що її нерухома фаза впливає на процес розділення. У широкому сенсі, колонки для РХ поділяються на колонки з нормальною фазою (утримують полярні сполуки) і колонки з оберненою фазою (утримують неполярні сполуки). Існують також інші типи, як-от іонообмінні або колонки для гідрофільної хроматографії (HILIC), що загалом забезпечує високі можливості розділення речовин. Розмір колонки, а також розмір і тип частинок також відіграють важливу роль у процесі розділення.

Загалом, менші розміри часток забезпечують більшу ефективність, але це призводить до підвищеного зворотного тиску (що може вимагати використання УВЕРХ системи для найменших частинок нерухомої фази), меншої ємності завантаження зразка і, якщо всі розміри колонки не масштабовані відповідним чином, зниженої роздільної здатності. Вибір правильної колонки для рідинної хроматографії полягає у знаходженні оптимального балансу між цими аспектами.

5. Детектор

Детектори для ВЕРХ/УВЕРХ визначають концентрацію елюйованих сполук у рухомій фазі, і їх можна поділити на два типи: специфічні детектори та детектори загальних властивостей.

Специфічні детектори: як випливає з назви, ці детектори реагують на певні сполуки, і їхня реакція не залежить від складу рухомої фази. Найпоширенішими прикладами специфічних детекторів є УФ/Вид детектори, оскільки вони реагують на сполуки, які поглинають ультрафіолетове або видиме світло певної довжини хвилі.

Детектори загальних властивостей оцінюють властивості, спільні для всіх аналітів, вимірюючи різницю в рухомій фазі зі зразком і без нього. Універсальний характер таких детекторів робить підвищений акцент на селективності хроматографічної колонки, і ці детектори мають обмежену чутливість. Найпоширенішим прикладом універсальних детекторів є детектор показника заломлення (RI).

Кожен тип детектора відрізняється чутливістю, специфічністю, селективністю та лінійним динамічним діапазоном, тому вибір детектора визначається цілями методу для конкретного застосування. 

6. Система обробки хроматографічних даних (CDS)

Як і інші хроматографічні методи аналізу, ВЕРХ вимагає використання програмного забезпечення — системи обробки хроматографічних даних (CDS) для підтримки збору, інтеграції, кількісного аналізу та звітності.

Протягом десятиліть програмне забезпечення CDS зазнавало вдосконалень, спрямованих на те, щоб зробити його функції більш надійними, потужними і простими у використанні. Інновації, спрямовані на підвищення автоматизації та продуктивності, зробили сучасне програмне забезпечення CDS ключовим компонентом хроматографічного робочого процесу в багатьох лабораторіях.

У цьому контексті стали ключовими аспекти, які стосуються інтерфейсу користувача (UI) і користувацького досвіду (UX), оскільки користувачі вимагають інтуїтивності, автоматизації та коротшого періоду навчання. Інтерфейс користувача (UI) та досвід користувача (UX) тепер формують цифровий досвід аналітичної лабораторії, забезпечуючи:

• Підвищення ефективності та продуктивності.

• Балансування потреб робочого процесу та аналітичних завдань.

• Гармонійне впровадження рішень для забезпечення відповідності вимогам.

Переклад за матеріалами: «Understanding the 6 Components of HPLC (No Pressure!)», https://blog.perkinelmer.com/